上海交大周永豐團隊: 超分子聚合增強自組裝囊泡光熱轉化效率44.1%,成為新型癌癥殺手

光熱療法(PTT)具有空間定向照射、微創和患者痛苦少的優勢,有望應用於癌癥和皮膚疾病的治療。囊泡光熱治療劑(PTA)的中空結構可以將入射光進行多次反射而擁有卓越的光捕獲能力及多功能性,受到廣泛關註。到目前為止,用作PTA的囊泡多是由脂質體等小分子自組裝而成,結構穩定性差。因此,開發結構穩定、光熱轉化效率高的囊泡型PTA非常具有挑戰性。

聚合物囊泡具有結構穩定的特點,在PTT的應用中具有很大的潛力。但是聚合物囊泡的光熱轉化效率差,難以作為PTA應用。這是由於脂質體的膜流動性比聚合物囊泡高得多,因此脂質體的發色團可以形成結構完美的π-π堆積狀態,而傳統聚合物囊泡則很顯得有心無力,因此光熱轉化效率較低。

成果介紹

基於以上分析,上海交通大學周永豐教授課題組首次提出將共價聚合物自組裝和超分子聚合相結合制備囊泡的設想,稱之為“超分子聚合增強的自組裝”(SPESA)過程,並基於超支化的卟啉自組裝制備出瞭納米聚合物囊泡(THPG)。發現這種囊泡具有堅固的膜結構和出色的膜流動性,膜內的卟啉單元通過定向π-π堆疊,可以形成結構完善的堆積狀態。在極低的激光功率密度下(200 mW·cm-2),THPG囊泡的溶液溫度從24.1℃可迅速升高至46.8℃,光熱轉化效率達到驚人的44.1%,而且具有優異的生物相容性。在對小鼠註射24小時後,THPG囊泡逐漸在腫瘤細胞內聚集,小鼠腫瘤在兩天後形成瞭焦痂, 14天後自然脫落,而且沒有復發,THPG囊泡對MCF-7腫瘤表現出具有優異的治療效果。

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囊泡自組裝和結構表征

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圖1. THPG囊泡的表征。(a)THPG囊泡的SEM圖像,插圖中的比例尺為30 nm;(b)THPG囊泡的TEM圖像,淺綠色的圓圈表示破碎的顆粒開口處非常明亮;(c)囊泡的STEM圖像和元素分佈圖,(d)為氮、(e)為鋅、(f)為氧、(g)為碳元素;(h)濃度為0.5 mg·mL-1的THPG囊泡溶液的SAXS光譜圖;(i)THPG在水、THF或5%Triton X-100洗滌劑水溶液中的UV-Vis光譜圖。

為瞭制備出囊泡結構,研究者以二環氧醚為A2單體,以四(4-羥苯基)卟啉鋅(ZnTHPP)為B4單體,進行瞭陰離子聚合反應,制備出瞭兩親性超支化多卟啉聚合物(THPG),分子量為6.4 kDa,分子量分佈為1.8。

SEM發現THPG的超分子聚集體為球形,平均直徑127 nm,從動態光散射(DLS)獲得的THPG流體動力學直徑為176 nm。有些納米顆粒破裂後顯示出內部的空心腔,表明該顆粒為聚合物囊泡,平均壁厚為約21 nm。THPG在四氫呋喃中的UV-Vis吸收光譜顯示出兩個強吸收區,分別為B帶(425 nm)和Q帶(從545至626 nm)的卟啉。然而,THPG囊泡在水中的吸收峰明顯加寬,B譜帶紅移至463 nm,Q譜帶延伸至560至650 nm波長,這表明THPG囊泡中卟啉之間的π-π堆積形成瞭強J聚集體。

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圖2. THPG囊泡的膜結構。(a)單個破裂的THPG囊泡的HR-TEM圖像;(b-c)為放大圖像,c中的插圖是c中選定的黃色正方形區域的快速傅立葉變換(FFT)圖像;(d)THPG囊泡的同步SAXS譜圖;(e)通過MD模擬瞭THPG囊泡中卟啉的堆積結構,e中的紅色方塊代表ZnTHPP部分;(f)THPG囊泡的示意圖;(g)放大的囊泡膜的橫截面示意圖;(h)THPG在囊膜中的堆積結構。

研究者詳細研究瞭THPG囊泡膜中的分子排列方式,采用高分辨率TEM對破裂囊泡進行觀察,發現疏水性卟啉單元通過π-π相互作用實現瞭超分子聚合,形成瞭黑色納米絲,親水性二環氧醚部分形成瞭白色條紋,黑色納米絲的平均寬度約9.3Å。同步SAXS測量也在q = 1.72和1.56Å-1處發現瞭兩個尖峰,這是相鄰卟啉單元之間的π-π堆積形成的。

研究者通過分子動力學(MD)模擬,證實瞭囊泡的自組裝機理,發現卟啉易於通過π-π堆積進行有序排列,並呈一定的螺旋角度,兩個卟啉單元之間的分子間距離為3.6 Å,由於π-π堆積每個卟啉對的平均能量為29.7 kCal·mol-1。

經過一系列結構表征和模擬研究,研究者認為THPG在水中在疏水相互作用的驅動下自組裝成膜厚度約為21 nm的囊泡。這種共價聚合物的自組裝過程觸發瞭分子內或分子間卟啉基團的緊密聚集,促使卟啉基團進行超分子聚合成平均寬度約為9.5Å的納米絲,並在π-π堆積的驅動下形成瞭少量螺旋J聚集體。本研究首次報道瞭通過共價和非共價聚合物自組裝過程,誘導形成瞭獨特的囊泡結構。

囊泡的光熱效率和穩定性分析

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圖3. THPG囊泡的光熱效率和穩定性分析。(a)THPG囊泡在各種THF/水溶液和5%Triton X-100洗滌劑溶液中的熒光光譜圖;(b)用635 nm波長的激光(200 mW·cm-2)照射並用熱像儀成像的PBS、0.3 mg·mL-1THPG膠束和0.3 mg·mL-1 THPG囊泡的溶液;(c)THPG囊泡冷卻時間與溫度負對數的線性擬合曲線(τ是樣品系統的時間常數);(d)在635 nm波長的激光(200 mW·cm-2)照射下水中的THPG囊泡的光熱穩定性評估。

THPG聚合物在THF中顯示出很強的熒光效應,但是在加入水後這一效應逐漸衰減,在純水中則完全淬滅。這是由於向THPG/THF溶液中加水後,觸發瞭THPG囊泡的自組裝過程。結果,由於π-π堆積相互作用導致瞭卟啉的超分子聚合,在囊泡內形成納米絲,從而造成熒光自猝滅。但是向THPG囊泡中添加5%Triton X-100清潔劑後,熒光恢復,這是由於π-π結構被破壞,囊泡分解造成的。

為瞭研究THPG囊泡的光熱性能,研究者通過紅外熱成像儀記錄瞭635nm激光照射後囊泡水溶液的溫度變化。發現即使在非常低的激光功率密度下(200 mW·cm-2),THPG囊泡溶液的溫度仍從24.1℃迅速升高至46.8℃,而PBS溶液的溫度僅升高瞭2.1℃,這說明THPG囊泡具有優秀的光捕獲並轉化為熱量的性能,經計算發現THPG囊泡的光熱轉化效率高達44.1%,遠高於大多數有機光熱劑。經過635 nm激光的三個加熱和冷卻循環後,THPG囊泡的平衡溫度依然保持在46.1℃左右,表現出優異的光熱穩定性,這與囊泡內卟啉之間的強π-π堆積相互作用、多層膜結構以及疏水單元之間的疏水作用密不可分。

囊泡光熱治療劑的體外細胞評估

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圖4. THPG囊泡的生物安全性和光熱效應的體外細胞評估。(a)MCF-7癌細胞在不同時間攝取THPG-Rb囊泡的代表性CLSM圖像,品紅色為THPG-Rb囊泡,藍色為細胞核中的Hoechst,比例尺為20μm;(b)在各種實驗條件下,用鈣黃綠素AM和碘化丙啶(PI)共同染色的MFC-7細胞的代表性CLSM圖像,綠色和紅色分別代表活細胞和死細胞,比例尺:150μm;(c)在有或沒有635 nm激光照射下,用各種THPG量孵育的MCF-7細胞的相對活力;(d)在有或沒有THPG囊泡的情況下,各種激光照射功率的MCF-7細胞的相對活力。

研究者通過甲基噻唑基四唑鎓(MTT)對NIH/3T3小鼠胚胎成纖維細胞的影響,評估瞭THPG囊泡在體外的潛在細胞毒性。發現即使在濃度高達0.2 mg·mL-1的THPG囊泡中孵育48 h後,3T3細胞的相對活力仍保持在86.0%,說明THPG囊泡對NIH/3T3無毒且生物相容性極好。

為瞭研究癌細胞對THPG囊泡的內化作用,研究者將MCF-7癌細胞與負載Rb的THPG囊泡在37℃下孵育,然後利用共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)進行觀察,發現隨著孵育時間從15分鐘增加到2 h,在癌細胞中觀察到THPG-Rb發出的紅色熒光持續增加,表明THPG-Rb囊泡被MCF-7細胞有效的攝取,在激光照射下,MCF-7細胞對THPG囊泡的攝取大大增強。

研究者進行瞭鈣黃綠素-AM /碘化丙啶(PI)雙重染色MCF-7細胞實驗,直接的觀察瞭體外THPG囊泡的PTT性能。發現攝取THPG後,MCF-7細胞非常健康。但是,以200 mg·mL-1的濃度與THPG囊泡孵育並用激光照射10分鐘後的MCF-7細胞,隨著激光功率的增加,死細胞的數量顯著增加。

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圖5. THPG囊泡的體內藥代動力學、成像和生物分佈研究。(a)在大鼠(n = 3生物學獨立的大鼠)中尾部靜脈註射THPG囊泡後,血液清除率曲線隨時間的變化曲線(ID代表註射劑量);(b)分別靜脈註射THPG-Cy7.5囊泡和Cy 7.5後,不同時間的MCF-7帶腫瘤小鼠體內熒光圖像(Ex:745 nm,Em:820 nm;模式:熒光),白色箭頭指示瞭腫瘤的位置;(c)分別在註射THPG-Cy7.5囊泡和Cy 7.5後,24小時的離體器官和腫瘤的離體圖像;(d)在註射1、4和24小時後,THPG的生物分佈。。

為瞭研究THPG囊泡在血液中的保留能力,研究者進行瞭藥代動力學研究。發現THPG囊泡的血液循環半衰期為29.5 h,具有較長的血液循環能力,這是由於囊泡良好結構穩定性造成的。註射後72小時後,血液中THPG的濃度很低,表明THPG囊泡可以從大鼠體內清除掉。

研究者向具有MCF-7腫瘤的小鼠靜脈註射THPG-Cy7.5囊泡(用Cy7.5的近紅外染料包裹的THPG囊泡),進行瞭動物熒光成像實驗。發現註射24小時後,體內遊離Cy7.5的熒光信號弱於THPG-Cy7.5囊泡,這表明THPG-Cy7.5囊泡在體內的保留時間更長。在註射後24小時後,Cy7.5不會在腫瘤組織中積累,相比之下,THPG-Cy7.5囊泡的熒光信號在腫瘤位置處在24小時後仍然很明顯。

研究者進一步研究瞭腫瘤和其他主要器官中THPG的累積。發現註射24小時後,在小鼠大多數器官中THPG含量顯著下降,但是腫瘤中的含量下降不明顯,表明THPG囊泡在24小時後逐漸聚集到腫瘤組織上。

囊泡光熱治療劑的體內動物評估

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圖6. THPG囊泡光熱作用的體內評估。註射PBS(a)和THPG溶液(b)並在635 nm激光下以200 mW·cm-2的功率照射10分鐘後MCF-7帶腫瘤小鼠的熱圖像;(c)通過熱像儀監測激光照射過程中腫瘤區域溫度變化的定量分析(n = 5個生物學獨立的實驗;(d)PTT處理後的小鼠照片;(e)不同組帶腫瘤MCF-7小鼠的腫瘤生長抑制譜;(f)MCF-7帶腫瘤小鼠在不同治療方式下的體重曲線(n = 3生物學獨立小鼠)。

研究者進一步研究瞭THPG囊泡在體內的PTT功效。發現在註射THPG囊泡後,激光照射60秒後,小鼠腫瘤的溫度從35.1℃升高到55.9℃,而對照組的小鼠腫瘤溫度僅從35.3℃略微升高到38.9℃,這說明THPG囊泡光熱傳遞效率非常高。

研究者將THPG囊泡註入小鼠體內4小時後,對腫瘤進行激光照射10分鐘,研究瞭腫瘤的演變情況。發現註射PBS的小鼠腫瘤持續增加,註射THPG的小鼠腫瘤在兩天後形成瞭焦痂,它在14天後自然脫落,而且沒有復發。

小結

為瞭制備出結構穩定的PPT光熱治療劑,上海交通大學周永豐教授課題組基於“超分子聚合增強的自組裝”過程,構建用於高效光熱療法的超支化多卟啉囊泡。發現制備的聚合物囊泡平均直徑為176 nm,具有出色的生物相容性、結構穩定性和膜流動性。在π-π堆積相互作用的驅動下,囊泡中的卟啉單元可以進一步自組裝成納米絲狀超分子聚合物,熒光自猝滅率高達1100,光熱轉化效率達到驚人的44.1%,在極低的激光功率密度下(200 mW·cm-2),THPG囊泡的溶液溫度從24.1℃可迅速升高至46.8℃。在註射THPG囊泡並激光照射60秒後,小鼠腫瘤的溫度從35.1℃升高到55.9℃,腫瘤在兩天後形成瞭焦痂,14天後自然脫落,沒有復發,所制備的聚合物囊泡對小鼠MCF-7腫瘤細胞顯示出優異的治療功效。

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