新型設計可註射高分子水凝膠材料用於防止脊髓損傷治療過程中移植的施旺細胞流失

脊髓損傷(SCI)是一種嚴重影響軀體功能的疾病,目前臨床上尚無基於受損脊髓再生的療法。脊髓損傷給患者及其傢人帶來瞭巨大的經濟,身體和情感負擔。基於細胞的療法已成為鼓勵脊髓損傷後再生和功能恢復的有前途的方法。目前,美國食品和藥物管理局針對胸部和宮頸水平為脊髓損傷的患者正在研究自體人施旺細胞(SCs)的移植 (圖1)。人施旺細胞是在周圍神經系統中發現的膠質細胞,其在周圍神經損傷後促進軸突再生。在過去的二十年中,數項臨床前研究表明,人施旺細胞在直接遞送至損傷部位後形成的病變腔中後可促進脊髓損傷後的再生。與可能的多能幹細胞脊髓損傷再生療法相比,施旺細胞的純度高,特征明確,並且相對容易從患者腓腸神經中分離和擴增。不幸的是將SCs直接局部註射到脊髓損傷中會導致大量移植的細胞丟失和死亡。在註射過程中,通常多達60%的細胞甚至無法到達目標部位。這可能是由於多種因素共同作用的結果,包括註射過程中細胞膜的損傷和脊髓中細胞的回流。此外,已有研究表明,細胞註射10分鐘後移植細胞的死亡便迅速發生,導致SC生存期較差。通常,隻有約20%的細胞在1周後存活,而不到5%的移植SC在移植後1個月存活,但是由於脊髓損傷病變中的移植體積有限,僅增加註射細胞的數量是不可行的。

新型設計可註射高分子水凝膠材料用於防止脊髓損傷治療過程中移植的施旺細胞流失
圖1. 細胞治療脊髓損傷示意圖

針對上述對於細胞治療脊髓損傷遇到的問題,斯坦福大學材料科學與工程學院Sarah C. Heilshorn 教授課題組在Science Advance發表文章提出使用可註射高分子水凝膠材料策略來解決阻礙脊髓損傷移植期間SC存活的三個關鍵挑戰。

新型設計可註射高分子水凝膠材料用於防止脊髓損傷治療過程中移植的施旺細胞流失

在這項研究中,作者們使用使用可註射高分子水凝膠材料解決阻礙脊髓損傷移植期間SC存活的三個關鍵挑戰(圖2)。在細胞遞送過程中,細胞損失是由(i)註射期間的拉伸力引起的細胞膜損傷和(ii)註射部位細胞的回流和滲漏引起的細胞流失。註射後不久,(iii)病變組織內缺乏細胞外基質(ECM),進一步降低瞭註射細胞存活率,導致依賴於貼壁生長的SCs的凋亡。因此,要使移植的細胞能夠與周圍的內源性組織相互作用並促進長期修復,細胞治療必須首先克服這三個關鍵挑戰。

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圖2. SC移植的挑戰

本文系統展示瞭水凝膠材料中設計瞭三個不同的特征,並且提出新策略以解決上述移植細胞存活的三個關鍵挑戰:(i)剪切力流變性以保護細胞膜在註射過程中不受損害;(ii)快速自我修復和原位硬度提升以穩定註射到脊髓損傷病變部位內的細胞,以及(iii)促進SC附著和添加促進細胞粘附性配體。

具體步驟:

1、可註射水凝膠的設計

水凝膠第一階段發生在重組蛋白(C7)和與富含脯氨酸的肽結合的多臂聚乙二醇(PEG)-聚(N-異丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)共聚物之間形成物理交聯(圖3,B和C)。這兩個組分通過兩個肽結構域(CC43 WW結構域和富含脯氨酸的肽)的可逆異二聚體結合異位組裝,從而形成帶有包封的SC的弱凝膠。當凝膠受到作用力時,肽-肽鍵斷裂,使材料剪切稀薄並以液體形式流動。消除作用力後,肽-肽鍵迅速重整,使凝膠快速自愈。

水凝膠交聯的第二階段發生在原位註射後,用以穩定和提升凝膠硬度從而防止細胞擠出和從病變部位中流失。在高於PNIPAM最低臨界溶液溫度32°C的體溫下,聚合物會發生分子內氫鍵作用力交聯,從而提供二次物理交聯來加強和增強水凝膠網絡(圖3B)。由於目前尚不清楚在脊髓損傷病變內能否保留可行的已移植SC的理想凝膠硬度,因此本文配制瞭具有一定范圍的熱響應性PNIPAM聚合物的材料,分別得到瞭軟凝膠,中等硬度凝膠和高硬度凝膠(圖3D)。這些材料涵蓋瞭脊髓損傷病變的報道的神經組織硬度的大致范圍。

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圖2. SC移植的挑戰

2、可註射水凝膠為註入的SC提供細胞膜保護。

當在註射針頭註射過程中受到拉伸力時,細胞會受到膜的破壞(圖2A)。假設即使在註射的流速非常慢時(500 nl / min)也會發生這種情況,因為溶液線速度的大小變化由註射器針頭裝置的幾何形狀決定。當細胞從註射器筒 [內徑(ID)= 0.485 mm] 進入超小針頭(33號,ID = 0.11 mm)時,流體線速度增加瞭20倍。為瞭評估設計的水凝膠材料在移植過程中保護SC免受細胞膜損傷的能力,本文使用體內移植研究(材料和方法)中所述的相同註射參數。當細胞在生理鹽水或C7 RGD聚合物的粘稠溶液(5 wt%)中遞送時,觀察到很明顯的細胞膜損傷(分別為25%和20%)。將C7 RGD聚合物與PEG-P-PNIPAM聚合物(均以5 wt%的最終濃度混合)可以產生剪切稀化的快速自修復水凝膠(圖4C),改變凝膠配方中細胞粘附配體或PNIPAM的量不會改變剪切稀化的凝膠行為(圖4C)。將這些SC預先封裝在這些水凝膠變體中,可在註射針頭流動期間提供顯著的細胞膜保護(圖4,A和D)。與在鹽水中遞送細胞相比,軟,中等硬度的水凝膠具有更高水平的細胞保護。材料中是否存在RGD細胞粘附域也不會影響細胞膜保護並且觀察到單獨的C7 RGD聚合物無法提供保護。這些數據表明,凝膠的剪切稀化/自修復特性(而不是凝膠細胞的粘合特性)是可註射水凝膠能夠提供細胞膜保護的原因。

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圖4. 可註射水凝膠可防止註射器針頭註射過程中對細胞膜損壞。

3 、註射水凝膠增加瞭移植的SC保留和擴散形態。

本文在雌性Fischer 344大鼠中選擇瞭單側頸挫傷脊髓損傷模型,以代表患者中最常見的脊髓損傷。在進行背側椎板切除術後在第五個頸椎(C5)水平上進行瞭右側的75-kdyne挫傷(圖5A)。在移植後48小時(N = 10)和4周(N = 16)評估移植的SC保留率。與體外移植模型數據一致,當在水凝膠中遞送時,與鹽水相比在病變部位觀察到的P75 +細胞數量明顯增加(圖5D)。在第48小時,在水凝膠註射的動物中觀察到32,000±7700個存活的移植細胞而接受生理鹽水註射的動物中發現4300±2500存活的移植細胞。在第4周,觀察到可註射水凝膠遞送瞭29,000±8000個活細胞,而鹽水遞送的動物計數瞭2400±800個活細胞,與鹽水相比,活細胞的局部遞送增加瞭約10倍。在兩個時間點的脊髓橫截面中與鹽水遞送相比觀察到瞭較多的SC遞送(圖5E)。結合本文的體外數據,這些觀察結果表明,使用剪切稀化的自修復水凝膠可通過在註射過程中提供細胞膜保護並限制細胞從註射部位滲出從而顯著改善SC向脊髓損傷病變部位的遞送。

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圖5,註射水凝膠遞送改善瞭宮頸脊髓損傷大鼠模型的短期和長期SC保留

4、水凝膠介導的細胞遞送增加功能恢復

本文評估瞭組合細胞和可註射水凝膠療法對功能性前肢恢復的作用。進行運動和感覺運動測試均可以獲得更正確的右前肢功能圖,因為挫傷性脊髓損傷可導致運動和感覺缺陷。為瞭評估前肢運動恢復,本文測量瞭前肢的抓地力,例如評估組合的力量和右臂力量用以評估左臂補償是否影響右臂行為。結果表明,單側C5挫傷會同時導致合並和右前肢握力下降,並且在僅右前臂的測試中這種下降明顯更大(圖6,A和B)。在合並前肢和右前肢評估中,觀察到與僅損傷對照組相比在可註射水凝膠中用SC進行治療的動物的抓地力顯著增加(圖6,A和B)。此外,在接受註射水凝膠治療的動物中,SC的右前肢握力明顯高於生理鹽水中的SC(圖6,A和B),但是在鹽水中用SCs處理的動物沒有觀察到明顯的改善。本文還通過水平梯步走試驗評估瞭動物的感覺運動恢復。該方法通過計算動物橫穿間隔不均勻的橫梯時前臂錯過的步數來測量前肢的協調性,觀察到頸挫傷後脊髓損傷遺漏的步驟明顯增加(圖6C)。

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圖6. 脊髓損傷後通過SC的註射水凝膠註射移植後可顯著恢復動物前肢功能。

總結與展望:

本文系統探究瞭新型設計的可註射水凝膠與生理鹽水遞送的臨床標準相比,讓註射的細胞在病變部位的保留能力有瞭顯著改善。大量的表征結果表明,可以通過使用水凝膠系統的模塊化設計,例如水凝膠與細胞粘附多肽進行組合從而通過完整系統的探究來進行進一步的優化以進一步提高細胞存活率。此外,在本研究報告瞭細胞加水凝膠聯合療法對脊柱再生和功能恢復的使用。未來繼續進行註射水凝膠優化的實驗機會凸顯瞭新型可註射水凝膠的應用潛力,不僅可用於脊髓損傷的治療,還可用於具有類似局限性的許多其他臨床適應癥。最後,雖然該研究集中在針對SC註射移植而設計的水凝膠的使用,但本研究對於使用其他細胞類型治療脊髓損傷具有更廣泛的意義。

參考文獻

Marquardt L M, Doulames V M, Wang A T, et al. Designer, injectable gels to prevent transplanted Schwann cell loss during spinal cord injury therapy[J]. Science Advances, 2020, 6(14): eaaz1039.

全文鏈接:

https://advances.sciencemag.org/content/6/14/eaaz1039

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