首創AIE點無創3PF顯微成像技術,實現活體腦卒中過程可視化

血管系統是循環系統的關鍵組成部分,應用熒光納米探針對活體腦血管進行可視化研究對瞭解常見的腦部疾病具有重要意義。雙光子熒光(2PF)顯微鏡由於其傳統的近紅外激發和低的光漂白傾向,通常被用於體內深層組織成像。然而,即使借助於顱窗,由於生物基質中激發光束的光散射,2PF成像通常也僅限於淺層深度成像。此外,由於整體顱骨永久性丟失,導致術後動物存活率低。自然環境的擾動和腦組織的炎癥是不可避免的破壞性幹擾,導致成像質量的降低。因此,用無創的方法觀察自然環境中的腦是研究腦疾病的理想方法。

為瞭解決上述問題,三光子熒光(3PF)顯微成像作為一種有效的成像方式正在迅速發展。與傳統的2PF成像不同,3PF成像技術利用近紅外區域(1000-1700nm)的高階非線性局域激發,顯著提高瞭穿透深度、時空分辨率和信背景比(SBR)。盡管有這些優點,3PF成像的一個主要限制是缺乏具有大的三光子吸收截面和高熒光量子效率的有機染料。

最近,香港科技大學唐本忠院士、中山大學梁國棟副教授和浙江大學錢駿教授合作在《Advanced Materials》上發表瞭題為“Facile Synthesis of Efficient Luminogens with AIE Features for Three‐Photon Fluorescence Imaging of the Brain through the Intact Skull”的文章,報道瞭他們在3PF成像有機染料方面的進展。他們通過簡單的反應路線合成瞭具有顯著聚集誘導發射(AIE)特性和高量子產率(42.6%)的固體發光材料。合成的BTF分子具有超亮的遠紅/近紅外發射,可以通過簡單的納米沉淀工藝制備成AIE點。AIE點具有高亮度、大的Stokes位移、良好的生物相容性、良好的光穩定性和大的三光子吸收截面,可以作為一種有效的熒光納米探針,通過三光子熒光顯微成像技術對完整的顱骨進行活體腦血管成像。這是第一個使用AIE點通過完整小鼠顱骨來可視化腦卒中過程的例子,且具有高穿透深度和良好圖像對比度。這些良好的結果有望為開發用於活體腦的無創生物成像、具有強非線性光學效應的高效發射體開辟一個新的途徑。

首創AIE點無創3PF顯微成像技術,實現活體腦卒中過程可視化

圖文導讀

1.AIE發光劑的分子設計與性能

作者設計瞭AIE發光劑BTF,它具有強電子供體三苯胺(TPA)、叔丁基(t-Bu)基團和電子受體富馬腈(FN)。BTF具有供體-受體(D-A)結構,使分子具有FR/NIR發射和明顯的多光子吸收。此外,BTF還含有更多可自由旋轉的苯環和t-Bu基團,有利於通過分子內運動消耗溶液態的激發態能量。這些運動被限制在聚集態,這使得激子能夠輻射衰減以促進AIE過程。此外,扭曲的TPA部分和BTF的龐大t-Bu基團阻礙瞭強π-π堆積相互作用的形成。這些因素使BTF具有長波長發射和高量子效率。

BTF在常見有機溶劑中具有良好的溶解性,但不溶於水。為瞭研究聚集和溶劑極性對BTF發射過程的影響,他們測量瞭不同水含量(fw)的THF/水混合物的PL光譜。BTF在純THF中發出微弱的熒光(圖1C)。當在BTF的THF溶液中加入少量水(fw≤50%)時,由於典型的扭曲分子內電荷轉移(TICT)效應,BTF的發射減弱。在極性環境中,這些分子經歷從供體到受體部分的快速分子內電子轉移,分子內D–A構象從共面結構轉變為扭曲構象。隨著水含量的進一步增加(fw≥60%),BTF分子由於疏水作用而形成納米聚集體。納米聚集體中的疏水環境緩解瞭TICT效應,使AIE效應作為主導因素更加明顯,導致BTF混合物的PL強度增加。當fw = 90%時,PL強度達到最大值,是純THF溶液的5倍(圖1D)。因此, BTF是AIE活性分子。純THF溶液中BTF的熒光量子效率(ΦF)為2.7%,在固態下顯著提高到42.6%。

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圖1 A)BTF的化學結構和B)合成途徑。C)不同水分數(fw)的四氫呋喃/水混合物中BTF的PL光譜。D)相對PL強度(I/I0)與BTF的THF/水混合物組成的關系圖。插圖:BTF粉末在365nm紫外線照射下的熒光照片。

2.生物成像應用

聚集體態BTF具有高ΦF的FR/NIR發射,可以用於生物成像。為瞭使疏水性BTF在水介質中具有良好的水分散性,采用兩親性聚合物Pluronic F-127作為生物相容性的封裝劑來制備BTF點(圖2A)。在水溶液中,Pluronic F-127和AIE分子的親脂部分形成納米點核,親水部分伸入水中形成外殼。BTF點在水溶液中的最大吸收波長為500nm,與515nm的商業激光激發非常吻合。BTF點的PL光譜在紅色區域(645nm)處達到峰值,並很好地延伸到近紅外區域(800nm)。BTF點比傳統有機染料(通常<25nm)具有更大的斯托克斯位移(>130nm),這有利於高對比度生物成像應用,因為自吸收的發射猝滅傾向較小。BTF點的熒光量子產率(ΦF)為36.1%。

BTF點具有長期穩定性。即使它們在磷酸鹽緩沖液(PBS)中的懸浮液在室溫下保存很長時間,它們的熒光光譜幾乎保持不變。而且BTF點的細胞毒性較低。在不同濃度(12.5、25、50和100mg mL-1)下與HeLa細胞孵育24小時後,細胞活力均保持在95%以上。BTF點具有較高的化學穩定性。將BTF點分散在不同的pH值的緩沖溶液下,未檢測到UV和PL的明顯變化。

他們繼續研究瞭BTF點的非線性光學特性。在1550nm的近紅外飛秒(fs)激光激發下,三個1550nm的光子在激發過程中同時被吸收,隨後發生與單光子過程相同的輻射衰減過程(圖2B)。在約650 nm處觀察到BTF點的明亮3PF,並在517 nm處觀察到來自三次諧波產生(THG)的尖銳信號峰(圖2B,C)。3PF和THG都是高階非線性光學效應。3PF最大發射波長位於650nm 的FR/NIR區域,它具有較高的穿透深度和較低的光吸收,所以BTF點的強3PF更適合於活體生物成像。在1550nm處,BTF的三光子吸收截面σ3為2.56×10-79cm6 s2,遠高於常用有機染料Rh6G(6×10-81 cm6s2)和一些先前報道的染料。BTF點的較高σ3值有利於深層組織生物成像。

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圖2 A)使用F127作為聚合物基質的BTF點的形成過程的圖解。B)1PF、3PF和THG過程的示意圖。C)1550nm飛秒激光激發下BTF在水分散體系中的非線性光學性質。插圖:毛細管內BTF水分散體的THG和3PF圖像。D)1550nm飛秒激光激發下BTF點熒光強度與功率的關系。E)1550nm連續激光輻照下不同時間點BTF點的3PF強度。

他們首先研究瞭使用3PF成像系統通過小顱窗對小鼠腦血管進行實時成像。如圖3A-C所示,3PF和THG信號匹配良好,這表明它們來自同一個納米探針。3PF和THG成像模式的結合提高瞭深部組織成像的可靠性。圖3D-F顯示瞭從0到900μm的不同穿透深度的小鼠大腦的三維高分辨率血管重建圖像。通過組合不同穿透深度的圖像(圖3J),從不同的視角(圖3K,L)重建高分辨率三維圖像,提供瞭關於主要血管網絡和微小毛細血管細節的清晰空間圖像。

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圖3 穿透深度為55μm的小鼠腦血管的A)THG、B)3PF和C)疊加圖像。D−F) 小鼠大腦血管穿透深度從0到900µm的體內三維高分辨率圖像。G,H)沿(D)和(E)中藍線測量的截面強度剖面。I)熒光信號衰減曲線。J)不同穿透深度的腦血管熒光圖像。小鼠大腦的血管穿透深度從0到900µm的3D圖像K)側視圖和L)頂視圖。

他們進一步將熒光BTF點應用於具有完整顱骨的小鼠腦血管可視化。圖4A-C顯示瞭小鼠腦血管的三維高分辨率重建圖像,該圖像提供瞭主要血管系統和微小毛細血管網絡的清晰空間圖像。所示微毛細管的半高寬在200μm深度處計算為0.95μm,在300μm深度處計算為1.59μm,在400μm深度處計算為2.08μm(圖5D-F)。

腦血栓形成是一種常見的腦部疾病,可導致急性腦損傷甚至死亡。因此,他們進一步利用BTF納米點來監測完整顱骨小鼠的腦卒中過程。首次利用AIE點對顱骨完整的小鼠大腦進行3PF成像,利用紅外減反射低倍物鏡獲得大視場血管結構的一般信息(圖4G,H)。在正常腦狀態下,可有效監測到來自血管的高達92.1的強3PF信號。腦血栓形成後,3PF強度顯著降低至1.1的低值,與背景信號難以區分。基於具有顯著非線性光學效應的超亮AIE點,他們首次以高對比度無創性地觀察瞭顱骨完整的活體小鼠腦血栓形成過程(圖4L)。

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圖4 A-C)具有完整顱骨的小鼠腦血管的活體三維高分辨率圖像,穿透深度為0至400μm。D–F)沿(A)–(C)中黃線測量的橫截面強度剖面。腦血栓形成前(G,H)和後(I,J)腦血管的G-J)3PF圖像。K)沿(G)和(I)中黃線測量的橫截面強度剖面。L)利用3PF顯微成像技術,基於AIE點的完整顱骨腦血栓形成過程可視化示意圖。

亮點小結

綜上所述,作者合成瞭明亮的AIE發光劑BTF,粉末狀態具有高達42.6%的量子效率。所得的AIE點具有高亮度、大Stokes位移、良好的生物相容性、良好的光穩定性和大的三光子吸收截面。它們可以作為高效熒光探針,用於高穿透深度和圖像對比度的近紅外激光激發活體腦血管成像。首次報道用AIE點無創3PF顯微成像技術觀察小鼠腦卒中過程。這些良好的結果將有助於開發高效的固態近紅外發射器,用於無創監測大腦疾病或功能紊亂。

全文鏈接:

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202000364

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