腫瘤胞吐小體/AIEgen雜化納米囊泡,促進腫瘤滲透和光動力治療

光動力療法(PDT)是一種臨床策略,其原理是利用光敏劑(PS)化合物在氧氣(O2)存在下暴露於特定波長的光,然後產生細胞毒性自由基和活性氧物種(ROS),如單線態氧,從而治療淺表性或局限性腫瘤及其他疾病。具有聚集誘導發射(AIE)特性的PS藥物的發展使PDT的新策略得以實現。AIE基熒光團以孤立分子的形式存在於溶液中時,其發射率最小,而當它們以聚集體的形式存在時,則會產生更強烈的發射。AIE發光劑(AIEgens)是生物成像應用的理想工具,因為它們具有高度的光穩定性、生物相容性,而且可以實現高對比度成像。重要的是,許多AIEgens可以很容易地產生ROS並用於基於PDT的治療幹預。不幸的是,大多數AIE-PS化合物是非常疏水的,因此不能很容易地用於體內生物環境中。之前的基於AIEgen系統的載藥量(DLC)低、包封效率(EE)低、對特定腫瘤的能力有限、組織滲透能力差,因此,開發新的基於AIEgen的平臺作為一種更有效地滲透腫瘤的手段是非常必要的。除上述局限性外,實體瘤中常見的缺氧腫瘤微環境(TME)由於缺乏O2而影響PDT的療效,而O2是這些治療策略有效性的關鍵。

腫瘤胞吐小體(exosomes,EXO)是增強AIE-PS腫瘤滲透和療效的一種潛在的理想途徑。EXO是一種小顆粒(50-200納米),由細胞分泌,來源於多泡體。EXO具有許多特性,包括缺乏免疫原性、良好的生物相容性、以及由於內源性來源而長時間保持循環的能力,使其成為很有希望的藥物傳遞的候選方法。還能夠穿過血腦屏障並深入到結構或其他致密組織類型中。重要的是,EXO可以被細胞內化,並且可以以基於EXO膜和細胞表面特異性蛋白質譜的特定方式歸屬於特定的組織或細胞類型。EXO不僅可以增加不溶於水的化合物的溶解度,而且也非常適合臨床藥物傳遞應用,因此,EXO/AIEgen雜化納米囊泡具有很大的潛力實現對癌癥有效的PDT治療。

最近,香港科技大學的唐本忠院士在《Angewandte Chemie International Edition》上發表瞭題為“Tumor-exocytosed exosome/AIEgen hybrid nano-vesicles facilitate efficient tumor penetration and photodynamic therapy”的文章,采用電穿孔法制備瞭腫瘤胞吐小體/AIEgen雜化納米囊泡(DES),該囊泡有助於腫瘤的高效滲透。然後使用地塞米松使TME內的血管功能正常化,以減少局部缺氧,從而顯著增強DES納米囊泡的PDT效果,使其能夠有效抑制腫瘤生長。他們首次實現瞭AIEgen與生物腫瘤胞吐小體的雜化,並將PDT方法與腫瘤內血管正常化相結合,作為減少局部組織缺氧的手段。

腫瘤胞吐小體/AIEgen雜化納米囊泡,促進腫瘤滲透和光動力治療

腫瘤胞吐小體/AIEgen雜化納米囊泡,促進腫瘤滲透和光動力治療
腫瘤胞吐小體/AIEgen雜化納米囊泡促進腫瘤有效滲透和光動力治療的示意圖

圖文導讀

1. DES的制備和表征

腫瘤胞吐小體/AIEgen雜化納米囊泡(DES)采用電穿孔法制備,其中AIEgen采用先前研究的DCPy(B. Z. Tang, ACS Nano 2018, 12, 8145-8159)。用膜熒光探針DiO對其進行瞭染色,可以在共焦顯微鏡下觀察到亮綠色的DiO熒光和紅色的DCPy熒光(圖1C),證實瞭DCPy在這些DES中的成功偶聯。此外DES納米囊泡的紫外可見吸收光譜在452nm處呈現出DCPy的吸收峰特征(圖1D)。根據DCPy電穿孔效率值,隨著初始DCPy濃度的增加,包覆效率緩慢上升,直至達到88.2%的最大值,比常用的聚合物納米粒子高很多。在4℃的PBS中儲存3天後,DES納米囊泡大小和zeta電位無明顯變化,表明這些顆粒高度穩定(圖1F和1G)。光致發光(PL)光譜分析表明,DCPy的AIE性質和DCPy的PL性質在DES形成後發生瞭藍移,再次表明瞭雜化納米囊泡的成功制備。

腫瘤胞吐小體/AIEgen雜化納米囊泡,促進腫瘤滲透和光動力治療
圖1(A)EXO和(B)DES納米囊泡的TEM圖像。(C)用共焦顯微鏡觀察DES納米囊泡內DiO(綠色)和DCPy(紅色)的共定位。(D)PBS中DCPy、EXO和DES納米囊泡的紫外可見光譜,插圖顯示DCPy(DMSO中)、EXO(PBS中)和DES納米囊泡(PBS中)的顏色。(E)EXO、DCPy和DES納米囊泡的Zeta電位值。(F)用DLS法測量瞭EXO和DES納米囊泡的水動力直徑。(G)分別於第1、2、3天測定懸浮於PBS中的DES納米囊泡的zeta電位。(H)含10%DMSO、100%DMSO和DES-PBS溶液的DCPy聚合懸浮液的PL光譜。插圖:在365納米紫外線照射下拍攝的DCPy熒光照片。(I)Western blotting檢測CD9(i)和CD63(ii)等外顯子標記。

2. 體外試驗

DES體外靶向癌細胞試驗。由於DES納米囊泡是由腫瘤細胞制備的,因此它們很容易被靶腫瘤細胞內化。DCPy在體內化後能夠特異性地染色活細胞中的線粒體,因此這種內化很容易被追蹤。他們將4T1細胞與DES納米囊泡一起孵育,並使用商業線粒體Mito-tracker Green FM探針進行染色(圖2A和2E)。30分鐘潛伏期後,可見DES納米囊泡附著在4T1細胞上,2小時後,DES納米囊泡內的DCPy染色可見腫瘤細胞線粒體。這些結果證實DES是靶向腫瘤細胞和線粒體的理想平臺。

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圖2(A)隨著時間的推移,4T1腫瘤細胞中Mito-tracker Green FM探針(綠色)和DCPy(紅色)或DES的共定位。(B)在正常或缺氧條件下,PBS、DCPy或DES治療和隨後532nm激光照射(0.5W/cm2,5min)後的相對腫瘤細胞存活率,通過MTT分析進行評估。(C)治療後腫瘤細胞熒光圖像和(D)DCFH-A熒光強度。(E)用ImageJ軟件對A的DCPy熒光強度進行瞭定量分析

DES顆粒體外PDT療效及生物相容性評價。這些AIEgen和DES的有效1O2生成對於PDT療效十分重要。因此,他們使用ABDA評估瞭它們產生1O2的能力,後者可能會被1O2氧化生成內過氧化物,從而導致ABDA吸收減少。在0.5W / cm2的照射劑量下,DCPy和DES存在下的ABDA吸收量急劇下降。而且,即使在高濃度的DCPy下,它們也具有令人滿意的生物相容性。然後在正常和缺氧條件下評估DES納米囊泡的PDT療效(圖2B)。在常氧條件下,DES或DCPy處理對適當的激光照射有顯著的光毒性。然而,在缺氧條件下,這種效果明顯降低。當使用DCFH-DA探針定量這些細胞中的活性氧產生時,正常條件下的熒光強度比缺氧條件下的明顯降低(圖2C)。證實氧水平可以深刻地影響DES或DCPy介導的抗腫瘤PDT治療方案的療效。

為瞭克服這一局限性,利用地塞米松(DEX)作為TME調節劑,作為改善這些腫瘤內有效氧供應的一種手段。為瞭證實該方法的有效性,從腫瘤植入後11-14天起,每天用DEX(3mg/kg)或PBS(n=3/組)皮下註射帶有4T1腫瘤的BALB/c小鼠一次。結果表明,與PBS治療相比,DEX治療明顯降低瞭低氧誘導因子HIF-1的染色強度,證實該治療幹預措施足以明顯緩解腫瘤內缺氧。

3. 體內試驗

DES的體內藥動學、生物分佈及腫瘤組織滲透性評價。除瞭具有高度的細胞毒性和易於被腫瘤細胞內化外,理想的抗腫瘤平臺還需要具有良好的系統生物分佈特征。為瞭突出DES在體內的生物分佈和藥代動力學特性,他們使用聚乳酸-乙醇酸(PLGA)來包埋DCPy,並成功制備瞭PLGA/DCPy雜化納米粒子(DPS),與DES進行對比。通過觀察4T1荷瘤小鼠(n=3/組)體內DES和DPS的分佈發現,DES和DPS在肝臟內的積聚相對較強,並且DES在動物體內表現出比DPS更有效的腫瘤傾向性(圖3D)。值得註意的是,在DES介導的治療(圖3E和3F)後,從血管中可檢測到約200μm的DCPy熒光,表明DES納米囊泡可以很容易地從血管中滲出,從而在有或無DEX的情況下深入腫瘤組織。

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圖3(A)PBS和DEX治療後的典型CD31(紅色)和αSMA(綠色)免疫熒光圖像。(B)PBS和DEX治療後具有代表性的HIF-1α免疫熒光圖像。(C)4T1荷瘤小鼠註射後48h主要臟器的活體熒光顯像和顯像。白色虛線表示腫瘤。(D)DCPy+DEX、DES納米囊泡、DPS+DEX或DES+DEX等劑量(5mg/kg)註射後12h DCPy組織生物分佈的定量研究。(E)在4T1荷瘤小鼠治療後12h的腫瘤組織切片中,DCPy(紅色)與CD31標記的內皮細胞(綠色)共定位。(F)DCPy在血管和腫瘤組織中的分佈特征。

DES體內PDT療效評價。他們將4T1乳腺癌小鼠隨機分為6個治療組:1)對照組(PBS);2)激光(L,532nm激光照射,0.5W/cm2,20分鐘,4個照射點,每個照射點5分鐘);3)DEX;4)DES;5)DES+L;和6)DES+DEX+L組(圖4A)。DES給藥與激光照射的結合介導瞭腫瘤生長的部分抑制,而當動物也用DEX治療時,這種抑制作用更為有效(圖4B、4C)。蘇木精和伊紅(H&E)染色的組織切片進一步證實,DES+DEX+L治療與大量壞死或凋亡腫瘤細胞死亡(圖4D)同時出現的顯著腫瘤組織丟失有關。用DCFH-DA測定這些治療小鼠的腫瘤內活性氧(ROS)的產生,顯示DES+DEX+L聯合治療小鼠的腫瘤染色明顯增強。這證實瞭在這些動物身上觀察到的增強療效與自由基生成改善有關。

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圖4(A) DEX+DES+L實驗設計綜述。(B)腫瘤體積隨時間的變化(C)治療後的平均腫瘤重量值。(D) 指定治療組的H&E染色腫瘤切片,並通過DCFH-DA染色測量腫瘤切片中的活性氧。

亮點小結

綜上所述,作者開發瞭腫瘤胞吐小體/AIEgen雜化納米囊泡。這些DES納米囊泡在體內很容易穿透腫瘤,當與DEX聯合使用時,作為缺氧TME血管正常化的一種手段,是PDT應用的理想選擇。首先,這種納米系統克服瞭在PDT中使用AIEgens的許多限制。此外,將這些仿生納米囊泡與DEX介導的腫瘤血管正常化治療結合起來,作為增強激光照射後腫瘤內ROS生成的手段,從而提高PDT的性能。總之,這項工作強調瞭一種新的腫瘤PDT方法,並強調瞭AIEgens的潛在臨床應用。

全文鏈接:

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202003672

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