​南京大學曹毅團隊: 合成蛋白水凝膠的最新進展

水凝膠是由物理或化學交聯的水溶脹性聚合物網絡合成的軟材料。由於其出色的生物相容性/生物降解性,與天然組織和器官相似的機械性能以及對環境的響應能力,水凝膠已被廣泛用於生物醫學應用,包括藥物輸送、生物傳感器、組織工程和再生醫學的合成細胞外基質(ECM)。最近,許多生物分子,包括蛋白質、肽、DNA和RNA被用作合成水凝膠的結構單元。蛋白質水凝膠因其可設計和可調節的生化及機械特性而倍受關註。南京大學的曹毅團隊在 ACS Macro Lett.上發表瞭“100th Anniversary of Macromolecular Science Viewpoint: Synthetic Protein Hydrogels”,以高分子科學的觀點綜述瞭合成蛋白水凝膠的最新進展。

​南京大學曹毅團隊: 合成蛋白水凝膠的最新進展

1. 從天然蛋白質到合成蛋白質/肽

天然蛋白質可從自然界獲得,已廣泛用於水凝膠。

例如,基質膠是多種結構的混合物蛋白質(包括層粘連蛋白、膠原蛋白和蛋白聚糖);來自單一蛋白成分的其他天然蛋白水凝膠(包括彈性蛋白、膠原蛋白、明膠(部分變性的膠原蛋白)、絲蛋白和球狀蛋白)。除瞭天然來源,蛋白質還可通過重組DNA技術和固相肽合成方法獲得。

蛋白質水凝膠可以完全由合成蛋白質制成,也可以由蛋白質和其他聚合物的混合網絡制成。

蛋白水凝膠的優點是合成步驟簡單,網絡結構相對更均一。與化學合成或天然衍生的聚合物相比,重組蛋白通常更昂貴。

全蛋白質和雜合蛋白質水凝膠都可以是動態物理凝膠或穩定的化學凝膠。在水凝膠網絡中,蛋白質既可以充當交聯劑,也可以充當承重模塊。

2. 蛋白質水凝膠的獨特性

與其他聚合物相比,蛋白質許多特性使蛋白質水凝膠具有多種功能。

蛋白質是具有明確定義的序列的聚合物,其分子水平上的化學性質(交聯密度和生物活性配體的數量)能夠很好被地控制。

其次,蛋白質一級序列編碼的獨特二級和三級結構使其有不同的機械性能。此外,自然界為水凝膠提供瞭豐富的蛋白質構件。

它們可以是來源於具有機械特性的結構蛋白,也可以是體內無機械功能的蛋白質。大多數蛋白質具有生物相容性,適合生物醫學應用。

3. 蛋白質模塊的結構和機械性能

水凝膠的機械性能是調節細胞增殖、擴散和分化的重要生理信號。細胞可以感知並響應水凝膠的多種復雜機械性能,包括彈性、韌性、應變軟化/剛度和應力松弛。這些蛋白質可以是生物環境中具有明確機械功能的天然蛋白質,也可以是不具有機械功能的蛋白質(圖1)。

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圖1. 合成蛋白水凝膠中使用的代表性蛋白構件。

彈性蛋白和節肢彈性蛋白是隨機線圈結構,並在體內起熵彈簧的作用。

它們與組織的彈性和可延展性相關,這些蛋白質可以使用重組DNA技術合成。

這些蛋白質的拉伸和松弛曲線是可逆的,無滯後現象。

彈性蛋白通常是高度水溶性的,化學交聯可形成水凝膠。彈性蛋白的可溶性及溶解度取決於它們的序列。

許多天然彈性蛋白是纖維狀的,但纖維狀結構的合成蛋白非常有限。與內在無序的蛋白質和纖維狀蛋白質相比,球狀蛋白質在性質上更為豐富,是天然細胞外基質的主要成分。

它們可以通過機械力展開,從而為材料提供可擴展性和韌性。

將不同的球狀蛋白結合起來可設計機械性能(包括彈性,韌性,可延展性和自愈性能)可調控的蛋白水凝膠。通過調節交聯劑和承載模塊的機械性能可半定量預測工程化水凝膠的機械性能。

4.化學交聯方法:

在水凝膠中,永久性共價交聯提供水凝膠所需的機械剛性,而物理交聯提供水凝膠的動態和響應特性(圖2A)。

理想的交聯方法是專一、快速、高產率的。通常這些交聯方法基於蛋白質酪氨酸、半胱氨酸和賴氨酸(圖2B)。

交聯方法包括光催化、酶催化、被氧化形成二硫鍵、巰基Michael加成與缺電子碳-碳雙鍵或自由基巰基烯與缺電子碳-碳雙鍵的反應。

這些反應並被用於設計蛋白質-聚合物雜化水凝膠。水凝膠也可以利用許多酶催化反應進行工程設計(圖2C)。

通常使用的連接酶包括sortase、裂腸肽、丁烯醛、磷酸泛乙烯基轉移酶和天冬酰胺基內肽酶。

它們可以連接特定的肽序列或肽配體形成共價鍵。這些酶促反應具有特異性和正交性。

當不同的酶被結合時,它們可用於復雜結構的水凝膠工程。

酶的濃度和活性可控制凝膠動力學,為控制凝膠動力學提供途徑。

其他一些能夠改變蛋白質疏水性或構象的酶也可以用來啟動蛋白質水凝膠的凝膠化,如基因編碼的點擊化學(圖2D)。

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圖2. 制備蛋白質水凝膠的化學交聯方法。(A)化學交聯方案。(B)酪氨酸、賴氨酸和半胱氨酸的典型化學交聯反應。(C)Sortase催化的肽連接構建蛋白質網絡。(D)基因編碼的SNAP-tag/BG和SpyCatcher/tag制備水凝膠。

5.物理交聯方法:

水凝膠也可以基於蛋白質-蛋白質或蛋白質-配體相互作用進行物理交聯。據估計,在人類相互作用體中存在∼650 000蛋白質-蛋白質相互作用。

然而,可用於交聯蛋白質水凝膠的相互作用對應滿足以下要求:

  • 1,交互對不應該太大,否則它們可能會影響在細菌中的溶解度和表達;
  • 2,應具有較強的親和力;
  • 3,綁定/解除綁定動力學也很重要。

水凝膠應具有良好的自愈性和註入性。然而,如果相互作用過於動態,水凝膠往往是不穩定。

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圖3. 幾種構建水凝膠的蛋白質-蛋白質/蛋白質-配體相互作用,包括螺旋線圈、WW結構域和二聚結構域。

6.刺激響應性:

許多蛋白質在體內負責信號轉導和能量轉換,這些功能往往是通過蛋白質的動態構象變化來實現的。

這種獨特的特性可以直接實現到蛋白質水凝膠中,以獲得刺激響應性。蛋白質水凝膠可以通過配體結合誘導蛋白質構象變化來響應不同的化學物質。蛋白質水凝膠可以通過化學變性劑和熱誘導的蛋白質折疊/展開來響應外界刺激,但化學變性劑會破壞蛋白質的穩定性,甚至導致蛋白質的去折疊,大大降低水凝膠的機械強度;溫度也有導致蛋白質的不可逆熱變性和聚集的缺點,盡管設計得當時可用於生產強韌蛋白質水凝膠。

pH和鹽離子響應性水凝膠也可以基於肽和蛋白質的折疊/展開進行工程設計。

光響應蛋白質水凝膠具有特殊的意義,它們可以無創、可逆地控制溶膠-凝膠轉變並在時空尺度上調節機械性能,許多光響應蛋白已被設計成響應水凝膠(圖4)。

光響應蛋白水凝膠可以通過三種不同方法工程化:

  • (1)光誘導蛋白質低聚物的離解/締合;
  • (2)蛋白質的光解;
  • (3)蛋白質的構象變化。

其他響應性水凝膠也被廣泛研究。如酶反應水凝膠可用於藥物控制釋放和細胞培養。

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圖4. 光響應蛋白質。

7.網絡結構:

水凝膠的穩定性和力學性能與其網絡結構直接相關,水凝膠網絡決定外力如何傳遞到單個蛋白質。

盡管大多數合成蛋白質是線性聚合物,但仍有很大空間改變網絡結構(圖5)。

蛋白質及蛋白質-蛋白質復合物的機械穩定性在很大程度上取決於拉力的方向。

蛋白質水凝膠中的蛋白質通常從其兩端承受拉伸力,但一些交聯方法隨機合成的水凝膠網絡拉伸方向不明確。

利用蛋白質工程技術可以明確蛋白質上的力方向,這對於物理交聯水凝膠尤為重要。

引入多臂交聯劑可以構建具有理想網絡結構的蛋白質水凝膠。具有新拓撲結構的蛋白質水凝膠的網絡由於精確的序列接近理想的網絡拓撲結構。

因此,多臂蛋白水凝膠的缺陷更小,力學穩定性更強。

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8.生物醫學應用:

蛋白質水凝膠的許多特性使其成為生物醫學應用的理想軟材料。

首先,它們可以使用細胞外基質的蛋白質構建為基礎,因而具有細胞相容性高,適用於多種細胞培養和體內應用。

水凝膠物理/化學性質對其他生物應用也很重要。

例如,在三維細胞培養時,溶膠-凝膠轉變速度應非常快,以避免細胞在包裹過程中沉淀;蛋白質水凝膠的力學性質可以作為一種控制細胞自我更新、增殖、遷移和幹細胞分化的新手段;當使用合成蛋白質水凝膠進行蛋白質和細胞傳遞時,剪切稀釋和自愈性能對治療藥物的註射性是必不可少的。

【結論和展望】

盡管合成蛋白水凝膠在軟生物材料領域中已經取得瞭很大的進步,但其工程設計仍然存在許多挑戰。

首先,合成蛋白的穩定性和產量難以提高合,成本降低困難。

其次,仍然很難用排列良好的纖維來復制自然組織的各向異性結構。

第三,需要系統研究來合理設計蛋白質水凝膠的機械性能。

第四,一旦將細胞培養在蛋白質水凝膠中,集成的系統便具有協同的機械性能。

此外,細胞培養過程中的動態響應會改變蛋白質水凝膠機械性能。

最後,盡管大多數蛋白質直接來自天然人類蛋白質,但其生物相容性應進一步被研究。

基於蛋白質水凝膠的獨特特征和該研究領域的迅速擴展,作者認為蛋白質水凝膠在未來有更廣泛的生物醫學應用。

一些成熟的蛋白質水凝膠可以作為實驗室細胞培養的標準材料,甚至可以作為醫學和臨床應用的新型生物材料進行商業化。

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