《Science》子刊:百裡挑一的抗真菌高分子材料

真菌能夠引起多種疾病,嚴重威脅著人類的健康。據統計,住院患者感染真菌的死亡率約為50%,全世界每年因為真菌感染會造成超過150萬人死亡。不僅如此,每年因為真菌破壞的食物足以養活6億人口。殺滅真菌如此之重要,迅速催生瞭一個每年全球總產值達300億美元的行業。目前,抗真菌隻要依靠抗菌藥物殺菌劑,在殺滅真菌的同時,也提高瞭其耐藥性,因此需要持續開發性能更好的抗菌藥物。

真菌一般需要附著在生物表面(如上皮細胞和葉子)和惰性表面(如醫療設備)上繁殖,才能引發感染。因此,防止真菌附著在生物表面也是一種抗真菌方法,但是這方面的研究和應用並不多。這是由於真菌在表面的附著本質上是一個被動過程,我們對真菌與不同表面相互作用的機制瞭解不多,因此很難設計出防止真菌附著的材料。

成果介紹

基於以上分析,諾丁漢大學Simon V. Avery教授課題組在高通量篩選瞭281種(甲基)丙烯酸酯聚合物後,發現兩種聚合物pAODMBA和pTEGMA可以減少人類病原體白色念珠菌、農作物病原體灰葡萄孢菌的附著,表現出優異的抗真菌性能:在3D打印pAODMBA人工瓣膜表面上真菌的附著力,與標準的有機矽瓣膜相比降低瞭100%。用TEGMA聚合物溶液處理的葉片儲存3天後也沒有發現灰葡萄孢菌的感染跡象,即時用水反復沖洗葉片,仍能保持良好的抗真菌性。這是世界上第一個通過高通量篩選聚合物以實現抗真菌附著的高分子材料研究。

《Science》子刊:百裡挑一的抗真菌高分子材料
高通量篩選抗真菌附著聚合物
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圖1. 聚合物微陣列篩選抗真菌附著材料。(A)通過yCherry表達或剛果紅染色檢測的白色念珠菌和灰葡萄孢菌的附著測試過程;(B)代表區域的顯微圖像,該區域包含聚合物微陣列載玻片上的六個聚合物點,比例尺150 μm;(C)6種聚合物的微陣列AFM高度圖像,以及所有陣列聚合物的模量(幹)和粗糙度直方圖,AODMBA:(R)-α-丙烯酰氧基-β,β-二甲基-γ-丁內酯;TEGMA:三(乙二醇)甲基丙烯酸甲酯;tBCHMA:甲基丙烯酸叔丁基環己酯;(D)灰葡萄孢菌在玻璃上粘附的顯微圖像(左上)以及具有不同附著特性的三種聚合物微陣列,右上圖聚合物斑點直徑約為300 μm;(E)在聚合物陣列上真菌的附著結果;(F)灰葡萄孢菌和白色念珠菌對不同聚合物的附著性比較。

為瞭篩選抗真菌附著材料,研究者以打印微陣列的形式篩選瞭281種丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯均聚物。他們采用原子力顯微鏡(AFM)對所有聚合物進行分析發現90%的聚合物薄膜均方根(RMS)粗糙度小於4.0,平均模量為2.8±0.7 GPa。

研究者在這些聚合物上培養瞭兩種真菌:白色念珠菌(yCherry標記)和灰葡萄孢菌(剛果紅染色),分別在2 h和6 h後確定材料的真菌附著性能。針對上述兩種真菌,研究者發現:3.9和1.1%的聚合物具有很高的真菌附著力(>中位附著值的1000%),2.5和3.9%的聚合物真菌附著力很低(<中值的10%),而且這兩種真菌具有不同的表面響應特性。

為瞭研究這兩種真菌在聚合物表面的附著模型,研究者采用機器學習(ML)方法評估瞭表面化學與每種真菌附著的關系,他們采用分子特征描述符和飛行時間二次離子質譜(ToF­SIMS)數據建立模型,采用XGBoost算法進行研究,發現根據描述符建立的模型效果較好,亞甲基腈C-CN和羰基C=O基團對白色念珠菌附著力最弱。最終,研究者篩選出瞭80種對這兩種真菌附著力最低的聚合物,其中27種對兩種真菌都有效果。

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圖2. 在篩選出的抗真菌附著材料上生物膜的形成。(A)在孔板上評估真菌生物膜的步驟;(B)白色念珠菌和灰葡萄孢菌在不同聚合物上形成生物膜的程度;(C)在對灰葡萄孢菌(B. cinerea)抗附著有效的聚合物薄膜上測試瞭絲狀真菌Z.tritici和巴西諾卡菌(A.brasiliensis)生物膜的形成。皮爾遜相關系數的R2和P值分別為0.307和0.014(Z.tritici和B. cinerea),0.558和0.0002(A.brasiliensis和B. cinerea)以及0.354和0.007(Z.tritici和A. brasiliensis)。

研究者繼續對篩選出的80種真菌附著力最低的聚合物研究其理化特性和生物學性能,真菌培養時間24 h,這樣就可以研究生物膜的附著性能。

發現對於白色念珠菌來說,有9種聚合物可以減少95%的生物膜附著;對於灰葡萄孢菌來說,有19種聚合物可以減少95%的生物膜附著;在篩選出的27種對上述兩種真菌都有效的聚合物中,有2種聚合物可以減少95%的生物膜附著。

研究者在對灰葡萄孢菌有效的19種聚合物上測試瞭絲狀真菌Z.tritici和巴西諾卡菌(A.brasiliensis)生物膜的形成,發現有15種聚合物對這三種絲狀真菌中的至少兩種有抗附著性能。

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圖3. 所選材料對真菌的抗附著與生長抑制作用。(A)白色念珠菌的附著和毒性;(B)在指定的培養時間後,從聚合物塗覆和未塗覆的孔中收集上清液CS,並將其添加到3T3細胞培養物中(10或100微升),24小時後測定乳酸脫氫酶(LDH)活性;(C)在聚合物塗覆的96孔板中培養15天的灰葡萄孢菌,比例尺1厘米;(D)24小時後,將含有浸出物的培養基轉移至預先附著6小時的灰葡萄孢菌的孔中,在24小時後通過OD600測定其生長情況。

考慮到聚合物成本、化學性質和毒性等因素,研究者選擇瞭9種聚合物:DEGMA和TEGMA(對兩種真菌有效);AODMBA、tBCHMA、tBCHA和iDMA(僅對白色念珠菌有效);mMAOES、DEGEEA和pEGPhEA(僅對灰葡萄孢菌有效)做進一步研究。發現白色念珠菌的生長不受任何聚合物的抑制,在標準10%或100%上清液的條件下,與未塗覆孔相比,用這些聚合物塗覆孔的上清液對小鼠3T3細胞沒有表現出明顯毒性。pEGPhEA則會強烈抑制灰葡萄孢菌的生長,這可能是由介質中殘留或浸出的有毒物質(如單體或低聚物)引起的。

真菌在AODMBA聚合物上的附著行為

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圖4. 3D打印AODMBA聚合物對白色念珠菌生物膜形成的抑制。(A)將AODMBA聚合物3D打印成不同的器件:3毫米直徑的樣片和1.9厘米長的人工瓣膜;(B)樣片上生物膜的形成;(C)接種48小時後,在瓣膜上用結晶紫(CV)染色的白色念珠菌生物膜,比例尺0.37厘米;(D)相對於未塗覆的微孔板,白色念珠菌CAF2-yCherry(WT)和耐唑類菌株SCS119299X和J980280在AODMBA上的附著百分比。

為瞭研究真菌在篩選出的聚合物上的附著行為,研究者以AODMBA聚合物為材料,采用3D打印技術制備瞭2種器件:3毫米直徑樣片和1.9厘米長的人工瓣膜,研究瞭白色念珠菌在其上的附著行為,並以PEG575DA材料打印的3D器件作對比。發現與PEG575DA相比,在AODMBA樣品上白色念珠菌的附著力降低瞭100%;在AODMBA瓣膜上真菌的附著力,比標準的有機矽瓣膜低得多,在某些瓣膜上附著力同樣降低瞭100%。這些結果表明AODMBA材料在臨床抗真菌性能上有潛在應用價值。

真菌在葉子表面的附著行為

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圖5. 植物葉子抗真菌感染實驗。(A)在灰葡萄孢菌感染(右)和未感染(左)之前,將20%的聚合物溶液噴塗到直徑1.5厘米的生菜葉上,每天檢查感染情況;(B)感染葉片的百分比;(C)TEGMA塗覆(底部)或未塗覆(頂部)葉片表面的掃描電子顯微鏡圖像(放大1000倍),比例尺20微米;(D)如(A)中所述,在感染前用水或不用水沖洗塗有TEGMA塗層的葉子。

研究者又將篩選出的聚合物應用於防止葉子被真菌感染的研究。發現在未噴塗聚合物的葉片上,2天後出現瞭明顯的真菌感染現象,而用TEGMA處理的葉片在3天後也沒有發現灰葡萄孢菌感染跡象,表現出良好的抗真菌感染性能。研究者在塗覆TEGMA後,用水反復沖洗葉片,然後接種真菌,發現3天後葉子仍然沒有感染跡象,表明這種聚合物塗層有良好的耐雨水沖刷性能,說明TEGMA聚合物在農業領域有潛在應用。

小結

目前抗真菌普遍采用藥物抑制的方法,隨著真菌耐藥性的提高,抗真菌藥物的研發受到巨大挑戰,諾丁漢大學Simon V. Avery教授課題組另辟蹊徑,在高通量篩選瞭281種(甲基)丙烯酸酯聚合物後,發現9種聚合物對白色念珠菌和灰葡萄孢菌具有優秀的抗附著效果。

研究者以AODMBA為原料采用3D打印技術制備瞭2種結構:3毫米直徑樣片和1.9厘米長的人工瓣膜,發現與PEG575DA材料相比,在AODMBA樣品上白色念珠菌的附著力降低瞭100%;在AODMBA瓣膜上真菌的附著力,與標準的有機矽瓣膜相比附著力同樣降低瞭100%。

用TEGMA聚合物溶液處理的葉片在儲存3天後也沒有發現灰葡萄孢菌感染的跡象,用水反復沖洗葉片後仍然表現出優秀的抗真菌感染性能。這一研究成果在臨床醫學以及農業領域有廣泛應用前景。

原文鏈接:

https://advances.sciencemag.org/content/6/23/eaba6574

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