四川大學《Science》子刊:直接在體內進行無創3D打印!

通過3D生物打印技術,科學傢們已經可以在體外得到各種人體器官和組織工程支架。但是想要把它們植入人體中,讓它們發揮應用的作用,就必須要對患者進行手術,暴露目標部位。然而手術總是會給患者帶來不同程度的傷口,甚至對患者造成二次傷害,這與當今臨床醫學的發展理念背道而馳。醫生和患者都希望盡可能地減少手術帶來的傷口和痛苦,因而醫學界急需一種無創3D生物打印技術。

基於數字化光處理(DLP)的3D生物打印技術具有生物相容性好、高細胞活性、打印精度高、打印速快的優點。但是傳統的DLP 3D生物打印技術都是基於紫外或藍光引發的光聚合反應開發的,這使其皮膚透過性較差,無法直接引發皮膚下的單體聚合。雖然目前可以通過混合上轉換納米粒子(UCNP)和紫外光活性的光引發劑實現近紅外光引發聚合,但是裸露的UCNP會造成紫外光泄露,降低引發速率並對人體造成傷害。

近日,四川大學生物治療國傢重點實驗室的茍馬玲研究員、錢志勇教授和魏霞蔚教授團隊在無創3D生物打印技術上做出瞭開創性的貢獻。

其核心為核殼結構的近紅外活性光引發納米粒子(UCNP@LAP),通過將紫外光活性的光引發劑苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸鋰鹽(LAP)靜電吸附在UCNP表面而非簡單混合,研究團隊大大降低瞭此類引發劑的紫外光泄露,在提高瞭光利用率的同時,還保證瞭引發劑的生物安全性。基於這種納米光引發劑,研究團隊開發瞭數字近紅外生物打印技術(DNP),通過連接有數控微鏡裝置(DMD)的3D生物打印平臺,紅外光被引向註射瞭單體、細胞和納米光引發劑的皮下組織,從而實現皮下3D原位生物打印。

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無創3D生物打印平臺

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圖 1 基於DNP的無創3D生物打印平臺示意圖

無創3D生物打印的基本流程如圖1所示。3D生物打印的原材料(納米光引發劑、單體和組織細胞)通過註射的方式固定在目標位置,DMD系統在接收到來自控制臺的CAD設計圖後,對近紅外光進行調制,然後投射到對應的皮下組織內,激活納米光引發劑,從而實現原位無創聚合。基於納米光引發劑的上轉換特性,傳統的生物相容性水凝膠單體都可通過近紅外光照射引發聚合。

納米光引發劑的表征及聚合活性

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圖 2 納米光引發劑UCNP@LAP的表征

傅裡葉紅外光譜(FTIR)、透射電子顯微鏡(TEM)和能量色散X射線光譜(EDX)分析結果表明LAP成功吸附在UCNP表面(圖2A、B),熱重分析結果表明LAP的負載量為12 wt%(圖2C)。通過對比LAP的吸收光譜和UCNP的上轉換發光光譜可以發現在980 nm近紅外光激發下,UNCP的紫外釋放峰值(320和380 nm)與LAP的紫外吸收區域有較好的重疊,並且UCNP@LAP的紫外釋放消失,證明該引發劑在近紅外光下具有良好的光吸收效率(圖2D)。將不同濃度的納米光引發劑UCNP@LAP(0.5、1、2 wt%)用於15 wt%的甲基丙烯酰化明膠(GelMA)的聚合反應的實驗結果表明提高引發劑濃度、延長聚合時間以及增加紅外光功率均可提高單體的反應程度(圖2E、F)。

DNP技術用於3D生物打印的可行性

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圖 3 使用DNP技術在體外3D打印無細胞結構
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圖 4 使用DNP技術在體內3D打印無細胞結構

為論證基於納米光引發劑構建的DNP技術用於無創3D生物打印的可行性,研究人員首先在體外用常用的生物材料GelMA為打印墨水,以逐層打印的方式打印瞭多種不包含細胞的微結構(圖3A)。為進一步模擬在體內打印的情況,研究人員又將老鼠皮膚或豬的肌肉組織覆蓋在生物墨水上,再進行打印(圖3C)。試驗結果表明組織下打印結構完整,形狀誤差控制在12.1%。最後,研究人員將不包含細胞的生物墨水註射到BALB/c小鼠皮下,進行瞭體內實驗(圖4)。在打印1天及7天後,打印結構及周圍的組織仍保持完整,並且沒有顯示出明顯的副作用,證明瞭DNP技術的3D無創打印具有應用於臨床治療的潛力。

基於DNP的非侵入式體內原位打印

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圖 5 采用DNP技術在體內無創3D打印類耳組織
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圖 6 采用無創3D生物打印脂肪幹細胞(ASC)骨架用以修復受損的肌肉組織

由先天畸形或外傷導致的耳廓缺損對患者的生理和心理有嚴重傷害。此類先天畸形在全球范圍內的發病率約為萬分之0.83 – 17.4,並且亞洲人發病率更高。這一疾病的治療手段包含瞭人造耳廓的體內移植,因而可能造成醫源性損傷。采用DNP技術,可以直接在體內生成相應的耳廓結構,從而避免瞭手術帶來的風險。研究人員采用小鼠作為模型,通過DNP在小鼠皮下無創打印瞭包含軟骨細胞的耳廓形結構,該過程耗時僅20 s。在一個月後,支架結構保持良好,並且軟骨細胞不斷成長,形成瞭可用於器官重構的耳廓結構。

脂肪幹細胞(ASC)具有治療由鈍器造成的閉合性組織損傷的潛力。通過DNP技術,可以在傷口處原位形成包含ASC的組織支架,有助於傷口愈合。研究人員采用帶有肌肉閉合性損傷的BALB/c小鼠為模型,采用DNP技術在傷口處打印瞭包含ASC的組織支架,在十天後,小鼠的傷口明顯愈合,並且H&E染色結果表明該支架對組織無副作用。

結論

DNP技術對於無創的體內3D生物打印的發展具有重要意義。生物墨水通過諸如註射和灌註等無創的方式遞送至目標位置,其聚合和打印則通過具有良好生物穿透性的近紅外照射平臺實現。因其無創的特性,該方法將大大推動3D生物打印技術在臨床上的應用。

全文鏈接:

https://advances.sciencemag.org/content/6/23/eaba7406

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