《Nature》譽為“糖之父”的Seeberger打破世界紀錄,史上最長人工合成多糖!

多糖是一類像核酸蛋白質的生物大分子,在生命過程中發揮著重要的作用。由於多糖的結構復雜而且存在微觀不均一性,其合成又沒有像核酸和蛋白質那樣有固定的模板可以遵循,因此多糖的合成問題長期困擾著合成化學傢。

阿拉伯半乳聚糖(Arabinogalactan)是一種重要的多糖,它是結核分枝桿菌細胞壁的重要組成成分,與細菌的存活力和致病力相關。該分子由一條半乳聚糖鏈(A鏈)和兩條緊密靠近的阿拉伯聚糖鏈(B鏈)所組成(圖1),具有高度分支的結構,其化學合成不僅為結核分枝桿菌細胞壁生物合成機制的闡釋提供基礎,而且有助於開發預防結核病的新型糖疫苗。正因為如此,該多糖分子近二十年來一直吸引著國內外糖化學研究小組的興趣;然而該分子結構復雜,其人工合成存在巨大的挑戰性。

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圖1.阿拉伯半乳聚糖的結構示意圖

2017年,北京大學醫學部葉新山課題組從簡單的單糖原料出發,采用他們前期所發展的基於糖基供體“預活化”的一釜寡糖合成策略(Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 43, 5221),以克級規模實現瞭寡糖鏈的大量制備;並且利用構象受限的糖基供體高立體選擇性地構建1,2-順式糖苷鍵;隨後再次使用“預活化”一釜寡糖合成策略分別完成瞭兩條多糖鏈(A鏈和B鏈)的快速組裝;最後采用他們自己發展的糖基化反應偶聯劑(Synlett,2006, 2846),經[31+31+30]糖基化反應將兩條B鏈與A鏈定點對接,順利實現瞭高度分支化、由92個單糖單元所組成的阿拉伯半乳聚糖的首次全合成。

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最近,受到自動合成多核苷酸和多肽的啟發,德國馬普研究所的Peter H. Seeberger教授課題組在自動多糖合成裝置(AGA)中,通過201個步驟,僅用188小時就合成出瞭100個鏈段長度的多糖碳水化合物,一舉打破瞭之前92的記錄,收率為5%。他們還將合成的30和31個鏈段長度的寡糖[31 + 30 + 30 + 30 + 30]通過偶聯反應制備出151個鏈段長度的枝鏈聚甘露糖苷,收率41%。這一研究提出瞭一種快速合成結構確定的長鏈多糖化合物的方法,必將有利促進生物和材料科學的發展。

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100個鏈段長度的直鏈多糖的合成

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圖1. 直鏈多糖的自動合成過程。(A)概念:每個過程由4步組成:酸洗、糖基化、保護未反應的親核基團、脫保護以進行下一個循環;(B)自動合成100個鏈段的α-(1-6)-多甘露糖苷4。

為瞭合成100個鏈段長度的直鏈多糖化合物,研究者在AGA中加入含有光裂解基團的聚苯乙烯Merrifield樹脂和19 μmol的甘露糖2進行反應,每個過程由4步組成:①酸洗20分鐘,以去除殘留的堿;②糖基化反應20-60分鐘,甘露糖為5-6.5當量;③保護未反應的親核基團30分鐘;④脫除Fmoc碳酸酯保護基團14分鐘,以進行下一個糖基化反應。上述4個步驟重復進行就能不斷增加多糖的鏈長。

隨著多糖鏈長的不斷增加,糖基化反應時間隨之增加,鏈長為40時,時間從20分鐘增加到40分鐘,超過80後,糖基化時間延長到60分鐘,經過188小時後多糖鏈段增長到100。最初加入瞭9 g甘露糖2,最終得到瞭39 mg 的α-(1-6)-聚甘露糖苷3,收率為5%通過自動合成方法,研究者合成瞭最長鏈段的多糖化合物,大大降低瞭合成時間

151個鏈段長度的枝鏈多糖的合成

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圖2. 從30個和31個鏈段長度的聚甘露糖苷(7、8和10)偶聯合成151個鏈段長度的支鏈聚甘露糖苷12。(A)利用AGA合成30鏈段長度的聚甘露糖苷7和8;(B)合成31個鏈段長度的聚甘露糖苷10;(C)8和10偶聯反應得到11。

為瞭制備出枝狀結構的多糖,研究者以樹脂5為載體,甘露糖2為原料,經過45小時合成瞭線性α-(1-6)- 聚甘露糖苷6,在光解、三氯乙腈或脫氧氟處理後得到瞭化合物7和8。隨後研究者以甘露糖2和分支結構9合成瞭31個鏈段長度的聚甘露糖苷10。

他們以三氟甲磺酸銀-茂鐵二氯化物為活化劑,以6當量的化合物8和10合成瞭151個鏈段長度的枝狀多糖11,收率為78%,同時還產生瞭20%的121個鏈段長度的副產物。

在化合物11中加入甲醇鈉處理16小時,以去除148個酯基保護基體,然後通入氫氣,以鈀/碳為催化劑,氫化72小時去除302個芐基醚和1個Cbz保護基團,最終得到瞭完全脫保護的化合物12,收率41%,通過1H、13C NMR以及MALDI-mass分析確定瞭支鏈12是迄今為止人工合成的最長枝鏈多糖。

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小結

德國馬普研究所的Peter H. Seeberger教授課題組在AGA中以PS樹脂為載體、甘露糖2為原料,僅耗時188小時就合成瞭100個鏈段長度的聚甘露糖苷化合物,收率5%,一舉打破瞭92個鏈段長度的記錄。

每個過程包括酸洗、糖基化、保護和脫保護四個步驟,重復這個過程就能不斷增加多糖的鏈長,隨著多糖鏈長的不斷增加,糖基化反應時間隨之增加,鏈長超過80後,糖基化時間提高到60分鐘。他們還以鏈長30的直鏈聚甘露糖苷7和8,鏈長31的枝鏈聚甘露糖苷10為原料合成瞭151個鏈段長度的枝狀多糖11,在脫除瞭148個酯基、302個芐基醚和1個Cbz保護基團後,得到瞭迄今為止最長的枝鏈多糖化合物,收率41%。

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