蛋白質合成革命!MIT《Science》:自動流動化學法合成多種蛋白質

蛋白質的生產是學術界和工業界研究的重要組成部分,可以通過生物學方法或化學合成來完成。大多數蛋白質是通過生物表達獲得的,該過程很大程度上限制瞭其化學組成到典型的蛋白原氨基酸上。遺傳密碼擴展前進已允許在天然蛋白質的結構中摻入多達兩個非天然氨基酸。相比之下,當需要整合多個非天然氨基酸,翻譯後修飾或人工骨架時,化學合成可提供無與倫比的靈活性。合成蛋白已經可以使用通過固相和結紮方法的結合。然而,蛋白質的總體化學合成仍保持高度勞動密集型。

蛋白質合成革命!MIT《Science》:自動流動化學法合成多種蛋白質

【研究成果】

由於無效的偶聯和副反應,長約50個氨基酸均質肽的固相肽合成一直是長期的挑戰。近日,Science雜志刊登瞭由麻省理工學院Hartrampf和Pentelute教授團隊最新成果。他們使用自動化化學平臺優化快速流動肽合成(即AFPS,優化傳統的固相態肽合成(SPPS)),並能夠產生完全合成的單結構域蛋白。

它們報告瞭高效的化學反應,以及與自動快速流動儀器相匹配的化學物質,可直接制造長達327個連續反應的164個氨基酸肽鏈。機器運行迅速:數小時內完成肽鏈的延伸。他們通過化學合成九種代表酶,結構單位和調節因子的不同蛋白質鏈來證明該方法的實用性。純化和折疊後,合成材料顯示出與生物表達蛋白質相當的生物物理和酶促性。高保真自動流動化學是生產無核糖體的單域蛋白的替代方法。相關鏈接發表在:DOI: 10.1126/science.abb2491

【圖文解析】

1. 快速篩選用於AFPS方案開發的反應變量

這篇文章報告瞭一個常規方案,該方案允許逐步化學合成長度超過50個氨基酸的肽鏈,每個氨基酸的循環時間約為2.5分鐘(圖1(A))。優化方案建立在通過AFPS系統獲取的分析數據集合的基礎上,可提供高保真度和高手性純度的產品。使用該方案,可以在3.5至6.5小時內合成從芽孢桿菌RNA酶抑制劑(90個氨基酸)到分選酶A59-206(分選酶A*,164個氨基酸)的單域蛋白鏈。為瞭證明功能蛋白的產生,將這些序列折疊,並確定瞭它們的生物物理特性和酶活性。化學蛋白質合成的時間尺度與重組表達的時6間尺度相等,因此為生物化學方法提供瞭一種實用的替代方法,同時開辟瞭超出規范氨基酸的化學空間。

作者首先優化瞭常規參數,包括流速,反應溶劑,試劑濃度,溫度和偶聯劑(圖1B)。研究瞭不同活化劑在偶聯步驟中的性能。還篩選瞭溫度,時間和活化劑以及不同的側鏈保護基團的影響(圖1C和D)。對於這兩種氨基酸,差向異構體隨激活時間和溫度而增加。事實證明,保護基團的選擇對於組氨酸至關重要。接著,作者確定瞭在這些優化條件下差向異構化作用的數量不會在多個偶聯循環中增加(圖1E)。

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圖1. 自動快速流動固相肽合成的優化條件可實現長氨基酸序列的高保真度生產。

2. 優化的AFPS優於傳統的合成方法

作者繼續調查瞭優化的AFPS條件是否可以用胰島素原(86個氨基酸)和人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)蛋白酶(99個氨基酸)作為測試序列來促進更長序列的合成。使用他們標準的AFPS方案,胰島素原和HIV-1蛋白酶的合成分別在3.5和4.5小時內完成。高效液相色譜(HPLC)純化產生2.2 mg(1%)的純化胰島素原和5.3 mg(1%)的純化HIV-1蛋白酶。在室溫,70°C和90°C的商用合成器上進行AFPS和標準一批次的SPPS合成之間的比較表明,優化的AFPS方案的合成效果得到瞭顯著改善(圖2) 。

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圖2. 胰島素原和HIV-1蛋白酶的合成證明瞭AFPS優於傳統SPPS方法的優勢。

3. 折疊的合成蛋白結構和功能與重組樣品相當

化學變性可用於評估合成蛋白的結構完整性和穩定性。球狀蛋白芽孢桿菌RNA酶(從解淀粉芽孢桿菌分離自細菌核糖核酸酶(RNase))是一個以研究蛋白質折疊,變性,並結合其抑制蛋白芽孢桿菌RNA酶抑制劑模型系統(圖4A )。通過液相層析串聯質譜(LC-MS)和HPLC方法無法區分合成和重組白芽孢桿菌RNA酶的一級結構(圖4B )。使用化學變性熒光測定法作為三級結構完整性的讀數器(圖4C )。

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圖4. 合成的芽孢桿菌RNA酶抑制劑和芽孢桿菌RNA酶抑制劑折疊成天然三級結構,並顯示出與重組樣品相當的酶活性。

HIV-1蛋白酶的一級結構通過LC-MS和HPLC方法確認(圖5B)。HIV-1蛋白酶水解HIV的肽,使用熒光肽可以量化其蛋白水解活性。合成的HIV-1蛋白酶的米氏常數(MIchaelis constant)為KM = 20.9 ± 1.0 μM,周轉數kcat = 29.6 ± 4.1 s-1,接近於相似文獻中發表通過SPPS獲得合成樣品的數值(圖5C)。將合成模型底物肽蛋白酶孵育,可產生類似野生型的在單個Phe-Pro位點上進行獨有分裂的特異性(圖5D)。

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圖5. 包含三個非規范氨基酸的合成HIV-1蛋白酶折疊成天然二聚體結構,並顯示出與文獻樣品相當的酶促活性和底物特異性。

【陳述總結】

經過優化的AFPS方案證明瞭流動化學優於常規一批處理的方法,所產生的肽鏈比常規標準SPPS可獲得的肽鏈長三倍以上。通過在可重現的反應裝置中快速篩選變量,實現瞭對現有流程方案的改進。自實施AFPS以來,作者已經生產瞭5000多種肽,並自動收集瞭所有合成的在線分析數據。展望未來,可以通過機器學習和其他計算方法來利用這一廣泛的高質量數據集來進一步改善流程中的肽合成。強大而廣泛使用的常規化學生產蛋白質的方法有望對化學生物學和新療法的發展產生重大影響。最後,AFPS具有按需按時生產的潛力,並可能挽救生命的個性化藥物,例如用酶替代療法或新抗原的癌癥疫苗。

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